差示掃描量熱儀解析DNA熔融的顯微結(jié)構(gòu)
 

　　1.   簡介
 

　　擔(dān)負(fù)著遺傳信息的DNA，即使是歸類于小種類的大腸菌，其染色體DNA的大小也巨大到約4700kb(1kb=1000堿基對(duì))，如果就這樣處理的話是很困難的，染色體DNA獨(dú)立地存在于細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)行自律增殖數(shù)質(zhì)粒DNA小到數(shù)kb到數(shù)百kb，處理起來比較容易，所以經(jīng)常被分子生物學(xué)作為研究對(duì)象或者研究手段。小型的質(zhì)粒DNA，作為物理化學(xué)的研究對(duì)象也是便利的材料。
 

　　DNA是由鳥尿環(huán)(G)，胞嘧啶(C)，腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶(T)4種堿基的共有結(jié)合而形成的2條互補(bǔ)鏈，通過GC間和AT間的氫結(jié)合以及鄰接堿基對(duì)間的如垛狀的弱結(jié)合力形成的2根鏈。因?yàn)榫哂羞@種構(gòu)造的DNA在比較低的溫度下解離(被稱為融解或者螺旋-線圈轉(zhuǎn)變等)成一條鏈，通過很多物理手段是可以觀測(cè)的。又因?yàn)槠浔容^簡單的模型，所以將其進(jìn)行理論化也相對(duì)比較容易。另外DNA的融解與細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)寫、重組等的遺傳基本現(xiàn)象有關(guān)，所以也成為了生物學(xué)和物理學(xué)的連接橋梁。
 

　　我們知道DNA的融解是在數(shù)十堿基對(duì)到數(shù)百堿基對(duì)間共同發(fā)生的。這被稱為融解的顯微結(jié)構(gòu)，此現(xiàn)象到目前為止主要通過紫外吸收、電子顯微鏡、凝膠電泳等方法觀察的。雖然通過熱測(cè)定來解析顯微結(jié)構(gòu)的報(bào)告目前為止是沒有的，這是因?yàn)闊釡y(cè)定中使用的DNA是染色體DNA和合成核苷酸這種巨大的DNA，或者如Oligo一樣是極小的DNA構(gòu)成的。比如染色體DNA的場(chǎng)合，因?yàn)閭€(gè)體過于大，各個(gè)顯微結(jié)構(gòu)重合成一個(gè)整體，所以只能觀測(cè)到一個(gè)幅寬的波峰，而合成核苷酸的場(chǎng)合，因?yàn)閴A基排列均一而且個(gè)體小，所以其特性會(huì)擴(kuò)及分子整體從而影響結(jié)果。
 

　　通過不斷的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)使用被稱為pJL3-TB5的5277堿基對(duì)而來的質(zhì)粒DNA，初次對(duì)DNA融解的顯微結(jié)構(gòu)利用差示掃描量熱儀(DSC)是可以測(cè)定的。而且，通過全堿基排列的理論性計(jì)算，就可以利用DSC曲線來解析堿基排列和遺傳因子。
 

　　這里，將闡述DSC測(cè)定Co/E1質(zhì)粒得理論性解析結(jié)果。
 

　　Co/E1是從6646堿基對(duì)而來，是產(chǎn)生抗菌性物質(zhì)大腸桿菌素E1的遺傳因子cea堆積的質(zhì)粒。而且Co/E1可以通過添加氯霉素來增加其產(chǎn)量，有容易得到樣品的優(yōu)點(diǎn)。
 

　　2.   方法
 

　　樣品：前述的Co/E1質(zhì)粒用銫-溴化乙錠法，再通過2次的超遠(yuǎn)心分離精制而成。得到的質(zhì)粒由于變?yōu)殚]環(huán)狀，所以難以產(chǎn)生融解不能觀測(cè)顯微結(jié)構(gòu)。限制性內(nèi)切酶EcoRI因?yàn)橹蛔R(shí)別Co/E1這個(gè)單一的位置，所以通過EcoRI切斷Co/E1使其變?yōu)橹辨湢睢?br /> 

　　用上述精制的Co/E1DNA330μg溶于60μl的1×SSC緩沖液(實(shí)際上是通過超濾溶媒置換)，放入70μl的密封樣品容器中進(jìn)行測(cè)定。升溫速度0.5K/min。
 

　　通過利用融解曲線和變性圖進(jìn)行理論計(jì)算：對(duì)于Co/E1DNA的全堿基排列6646堿基對(duì)，用AT和GC這2種進(jìn)行分配參量，并分別在69.5℃和110.5℃時(shí)進(jìn)行計(jì)算。
 

　　3.   DSC曲線
 

　　圖1-(1)是用上述方法得到的Co/E1DNA的DSC曲線。83℃開始到98℃能看到DNA階段性的融解時(shí)的11個(gè)波峰。(2)是降溫過程的DSC曲線，顯示了暫時(shí)從1根鏈中解離的DNA再度和2根鏈會(huì)合的過程，(3)顯示的是再升溫過程的DSC曲線，再會(huì)合的2根鏈DNA再次解離的過程。曲線(2)，(3)的各波峰分離雖然沒有(1)那樣好，會(huì)合、再融解的反應(yīng)也是階段性進(jìn)行的。曲線(4)是通過理論推斷得到的融解曲線。這里縱軸表示的是各溫度下螺旋線含量的溫度微分。(1)和(4)的各波峰標(biāo)注的號(hào)碼，表示分別對(duì)應(yīng)的波峰。雖然有若干的差異，但是DSC曲線和理論曲線近乎一致。這表示理論推斷的可信性相當(dāng)高，使得進(jìn)一步的解析變得可能。
 

　　4.   變性狀態(tài)的理論性解析(變性圖)
 

　　通過觀察DSC曲線上各波峰前后的DNA變性狀態(tài)，可以知道分子鏈上哪一個(gè)領(lǐng)域的融解分別對(duì)應(yīng)哪個(gè)波峰。因此變性圖是將某個(gè)溫度下各堿基對(duì)變成線圈狀態(tài)(解離狀態(tài))的概率對(duì)應(yīng)到各堿基對(duì)位置而制成的圖表。圖2顯示的是圖1-(4)的理論融解曲線中，各波峰的前后用a.b.….j表示的各溫度的變性圖計(jì)算結(jié)果。圖的橫軸，通過限制酵素EcoRI將切斷點(diǎn)作為原點(diǎn)。涂滿黑色的地方是融解的部分。DSC曲線上各波峰，是DNA分子鏈哪個(gè)部分的融解就很容易了解到。比如，DSC曲線的波峰1，相當(dāng)于圖2的變性圖中a的狀態(tài)變化為b的狀態(tài)，是堿基位置100到400的領(lǐng)域的變性和5050到5200的小區(qū)域的變性疊加的結(jié)果。而且，從此圖可以了解到融解是互相協(xié)同進(jìn)行的。比如圖的左側(cè)的低溫下融解的部分，到相當(dāng)高的溫度為止融解雖然不是向內(nèi)部進(jìn)行，但是在某一溫度下會(huì)急速的在廣區(qū)域中融解的現(xiàn)象產(chǎn)生。右側(cè)部分也可以看到是同樣的共同融解。這樣的情況如果做成熱穩(wěn)定性圖的話會(huì)變得更加明了。
 

　　5.   變性圖和遺傳因子圖的比較
 

　　圖2的上部，顯示的是Co/E1的遺傳因子圖。和變性圖比較的話在遺傳因子的頂端(涂層區(qū)域和非涂層區(qū)域連接部分)很多場(chǎng)合溶解的方式是在變化的。也就是，表示涂層區(qū)域和非涂層區(qū)域穩(wěn)定性上存在差異。與圖2相鄰的變形圖之間取差或者制作熱穩(wěn)定性地圖進(jìn)行調(diào)查的話，這個(gè)情況更加明顯。如此融解區(qū)域內(nèi)存在差異，是否僅僅是反映進(jìn)化過程中堿基置換或重組，還是對(duì)于遺傳性機(jī)能發(fā)現(xiàn)有特別的意義是一個(gè)有趣的問題，現(xiàn)在仍然不是很清楚。